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 引言

      γH2AX 是染色体组蛋白H2A家族的成员之一。在各种理化因素刺激下，细胞DNA双链发生断裂，ATM、ATR等磷脂酰肌醇3-激酶使H2AX上的第139位丝氨酸发生磷酸化修饰，形成磷酸化的γH2AX 。γH2AX作为一种生物标志物可以清楚地反映DNA损伤程度和修复情况, 被国内外广泛应用于细胞凋亡研究中, 是细胞损伤应激反应的研究热点之一。常见的γH2AX鉴定分析方法包括免疫发光法和质谱法，但因复杂预处理过程会假阳性。因此原位实时检测细胞核内γH2AX对于准确评估遗传毒性至关重要。SERS技术具备原位、无损、预处理简单、高灵敏度等优势，有望用于γH2AX原位分析。但是，SERS检测细胞核内物质仍面临巨大挑战。SERS增强效果与粗糙金属尺寸相关，颗粒直径越大，振荡频率和增强效果越好。进入细胞核内需要穿过核孔，其限制直径尺寸为10-30nm，粗糙金属颗粒尺寸小导致SERS增强效果弱。在现有技术中，主要通过修改核定位序列实现主动运输至细胞核来实现核内检测，该技术提高了进核效率，却因基质存在而产生背景干扰。

在本文中，南京师范大学王琛教授课题组构建了一种基于金纳米粒子（GNPs）的小型免疫传感器SERS探针，成功检测受限靶点γH2AX，评估药物遗传毒性。作者利用γH2AX作为限制靶点的特性，构建了一种基于小尺寸（15nm）金纳米探针的γH2AX免疫传感器，并用TAT核靶向肽对其进行了修饰，以确保高的核进入效率。一旦DNA损伤被诱导，γH2AX的局部过表达通过免疫识别进一步募集探针，从而可以原位组装热点，将增强拉曼信号用于遗传毒性检测。本研究提出了一种研究提出了一种新的SERS检测受限靶诱导的尺寸转换和热点形成的方法，用于分析核内遗传毒性标志物。该技术的优点在于简化了SERS探针的结构和操作过程，避免了对含有热点的系统的额外设计，从而减少了背景信号，从而为在单个活细胞水平上原位实时检测核内靶标提供了参考。

结果分析

作者利用γH2AX作为限制靶点的特性，构建了一种基于小尺寸（15nm）金纳米探针的γH2AX免疫传感器，探针以4-巯基苄腈（4-MBN）修饰的15nm GNPs为增强颗粒，PEG2000为稳定链，TAT为穿透肽，γH2AX单克隆抗体为探测识别物，建立为抗-γH2AX@GPMT的SERS传感器。

实验时通过TAT穿透肽的小颗粒和核靶向功能进入细胞核，将构建的SERS细胞传感器与药物一起孵育。若药物没有遗传毒性探针以分散状态分布，拉曼信号弱。相反，如果药物具有遗传毒性发生DNA损伤，产生γH2AX的局部表达，诱导探针进一步免疫识别和聚集，在原位构建增强热点，产生高强度拉曼信号实现遗传毒性鉴定。

图1 （A）抗-γH2AX@GPMT制备原理图；（B） GNPs的ζ电势图；（C）不同GNPs紫外-可见光谱图；（D）不同基质拉曼光谱图（1592cm^-1和2230 cm^-1是4-MBN特征峰）；（E）抗-γH2AX@GPMT的TEM图像；(F) anti-γH2AX@GPMT的EDX图

图2 （A）抗-γH2AX@GPMT的检测策略.（B）TAT修饰不同尺寸SERS基底Au尺寸分布（C）15nm抗-γH2AX@GPMT在2230 cm^?1处的暗场、明场和拉曼光谱图（D）30 nm抗-γH2AX@GPMT在2230 cm^?1处的暗场、明场和拉曼光谱图（E）MMS孵育前后SERS强度差值。（F）抗-γH2AX@GPMT的MMS平均需求量

图3 （A）γH2AX靶点体外模拟方案略.（B） γH2AX尺寸与PH值关系（C）加入抗-γH2AX@GPMT.后实物图（D）不同PH值孵育环境下，抗-γH2AX@GPMT的拉曼光谱。（E） 抗-γH2AX@GPMT在2230cm^-1拉曼强度与PH值关系。（F） 不同浓度的γH2AX肽孵育的抗-γH2AX@GPMT的拉曼光谱图（G）抗-γH2AX@GPMT在2230cm^-1拉曼强度与γH2AX肽浓度关系

图4 抗-γH2AX@GPMT的靶诱导机制.（A）加入γH2AX肽前后抗-γH2AX@GPMT的TEM图像（B） 抗γ的生物TEM图像H2AX@GPMTγH2AX孵育前后。（C）抗-γH2AX@GPMT拉曼光谱（D）抗-γH2AX@GPMT的2230 cm^?1拉曼光谱归一化强度

图5 SERS传感器优化和表征。（A）不同时间下细胞摄取抗-γH2AX@GPMT显微图像（B） 加入GNP和抗-γH2AX@GPMT后L02细胞活性（C）不同传感器的CYP450代谢酶活性。

图6（A）药物遗传毒性评价方案。（B） 在不同时间MMS孵育时间细胞暗场、明场和拉曼Mapping图（2230 cm^?1峰位）。黄色实线区域为拉曼采集区。黄色虚线圆圈表示细胞核区域（C）在不同时间MMS孵育时间细胞暗场、明场和拉曼Mapping图（2230 cm^?1峰位）。（D） 不同孵育时间下2230 cm^?1的拉曼平均强度

结论

本研究以γH2AX为细胞核内定向靶点，突破了SERS探针进入细胞核效率和信号增强因子之间的局限性。构建了一种基于GNP探针的γH2AX免疫传感器来评估药物遗传毒性。该传感器具备TAT膜穿透性和核靶向功能，使小颗粒探针能够穿过核孔并成功进入细胞核。该探针进入细胞核内后，GTIs诱导DNA损伤和γH2AX局部过表达，导致原位构建增强热点并产生强拉曼信号，进一步增强了探针的免疫识别性能，解决了小探针增强性能差和大探针入核效率差的矛盾难题。本文所设计SERS探针可原位分析细胞核内遗传毒性，为药物遗传毒性筛选提供了一种新方法，也为细胞核内原位实时检测提供了实验灵感。

南京师范大学王琛教授课题组简介

王琛，南京师范大学化学与材料科学学院教授，博士生导师，国家优秀青年科学基金获得者（2020年），江苏省“青蓝工程"优秀青年骨干教师、中青年学术带头人；南京师范大学本科、硕士，2011年博士毕业于南京大学化学化工学院生命分析国家重点实验室，2012-2016南京大学从事物理学博士后，2016-2017年麻省理工学院（MIT，美国）访问学者。至今，在Angew. Chem. Int. Ed., Sci. China Chem., Nano lett., ACS Nano, Anal. Chem.等学术期刊发表研究论文60 余篇；参编英文图书 《Nanobiosensors: From Design to Applications》(Wiley)；主持多项国家自然科学基金、江苏省重点研发、江苏省自然科学基金等项目；担任Chinese Chemical Letters期刊编委，中国分析测试协会青年学术委员会委员，江苏省材料学会副秘书长。

文章信息

本文以“Confined Target-Triggered Hot Spots for In Situ SERS Analysis of Intranuclear Genotoxic Markers"为题发表在Analytical Chemistry上，中国药科大学韩凌飞为第一作者，南京师范大学王琛教授和中国药科大学柳文媛教授为通讯作者。

本研究采用的是北京卓立汉光仪器有限公司RTS2 多功能激光共聚焦显微拉曼光谱仪，如需了解该产品，欢迎咨询。

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